La Fluorescencia

Es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.

La energía total emitida en forma de luz es siempre menor a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayoría de los casos la longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energía- que la absorbida, sin embargo, si la radiación de excitación es intensa, es posible para un electrón  absorber dos fotones; en esta absorción bifotónica, la longitud de onda emitida es más corta que la absorbida, sin embargo en ambos casos la energía total emitida es menor que la energía total absorbida.

En general las sustancias fluorescentes absorben energía en forma de radiación electromagnética de onda corta ( ej. radiación de gamma, rayos X, UV, luz azul, etc.), y luego la emiten nuevamente a una longitud de onda más larga, por ejemplo dentro del espectro visible; los ejemplos más notables de fluorescencia ocurren cuando la luz absorbida se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro -invisible al ojo humano- y la luz emitida se encuentra en la región visible.

El mecanismo de fluorescencia típico implica tres pasos secuenciales, llamados respectivamente absorción (1), disipación no radiactiva (2) y emisión (3).

El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del orden de los nanosegundos, por lo que puede considerarse prácticamente instantáneo. Es este tiempo tan corto lo que diferencia a la fluorescencia de otro conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia. El mecanismo de fluorescencia también se encuentra muy relacionado con el proceso de quimioluminiscencia.

Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de radiación se denominan fluoròforos. Es posible obtener una amplia variedad de colores por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto fluorescente.

Bioluminiscencia

  Es la producción de luz por parte de organismos vivos. Mediante una reacción química de determinados reactivos, se produce además de productos derivados, luz (o para ser más específico, fotones). Es uno de los comportamientos animales más increíbles de la naturaleza, un sorprendente y mágico efecto visual de producción de luz que solo unos pocos seres vivos pueden llegar a utilizar usando evolucionadas técnicas y control de reacciones químicas.

          Esta es una pequeña presentación de algunos de los organismos vivos, bacterias, hongos, protistas unicelulares, celentéreos, gusanos, moluscos, cefalópodos, crustáceos, insectos, equinodermos, peces etc. que son capaces de producir fluorescencia.

   Escorpion Frantisek Kocarik

   Se conocen unas 1.753 especies del Frantisek Kocarik que se encuetran en las zonas de clima templado y tropical. Aparecen practicamente en cualquier hábitat, desde los bosques hasta desiertos. Los escorpiones son cazadores nocturnos que se alimentan de otro artrópodos y la mayoria vive en el suelom aunque hay algunos que se adaptan a vivir en árboles.

Durante el día buscan refugio y a veces lo hacen en los lugares más insospechados. Las características más curiosas de estos arácnidos: la fluorescencia.

         Todos los escorpiones emiten una fluorescencia (con una longitud de onda entre los 440 y los 490 nanómetros) cuando se iluminan con luz ultravioleta. Este fenómeno fué descubierto casi simultáneamente en 1954 por el zoólogo italiano M. Pavan y el zoólogo sudafricano R. F. Lawrence y revolucionó el estudio de la biología y ecología de los escorpiones gracias a que fue posible localizarlos y observarlos por la noche usando lámparas de luz negra.

      La intensidad de la fluorescencia aumenta con la edad del escorpión y la dureza de su cutícula y es más brillante en las zonas más duras. Por lo general, durante la primera fase del desarrollo de los escorpiones (antes de la primera muda), la fluorescencia es débil o inexistente y la van desarrollando sobre todo a partir de la tercera muda. Cuando muda un escorpión, la exuvia (cutícula vieja) mantiene la fluorescencia, mientras que la nueva cutícula blanda no es fluorescente y va adquiriendo sus propiedades fluorescentes a medida que se endurece (esclerotización). Esto sugiere que los compuestos fluorescentes se segregan nuevamente después de la muda o se forman durante el proceso de endurecimiento. Una vez adquirida, la fluorescencia persiste incluso después de la muerte de escorpión.

          La fluorescencia se debe a la existencia de dos compuestos químicos en la cutícula: β-carbolina y 7-hidroxi-4-metilcumarina. Estos dos compuestos se encuentran en la exocutícula hialina, una región de la cutícula que en los escorpiones tiene un espesor de 4 micras. La cutícula es una especie de «piel» que protege a los artrópodos y al estar endurecida, también actúa como armazón que les permite mantener su forma. En los escorpiones, la cutícula está formada por la epicutícula, una capa fina y externa, la exocutícula, dividida a su vez en dos capas, la exterior o exocutícula hialina y la interior o exocutícula interna, y la endocutícula.

Calamar Volador de Fuego

  El calamar volador de fuego o Watasenia scintillans, emite intensos destellos de luz de tres pequeños órganos luminosos que se encuentran en la punta de cada uno de un par de brazos ventrales. La luz también se produce a partir de cientos de otros órganos de la hora que se encuentran dispersos por todo el cuerpo. La luminiscencia se debe a una reacción dependiente de ATP, con un pH óptimo de 8,80. La decadencia de la intensidad de la luz sigue cinética de primer orden y la constante de desintegración es independiente de la concentración inicial de ATP. La emisión de luz también requiere MgCl2, un componente soluble, y un componente insoluble que es unido a la membrana. Calamares representan un grupo importante de organismos no relacionados con las luciérnagas en la que el ATP se requiere para la bioluminiscencia.

Cerdo

      Una cerda transgénica con varias partes de su cuerpo fosforescentes ha parido dos lechones que han heredado sus brillantes características tras ser cruzada con un macho ordinario, según ha anunciado la investigación elaborada por una universidad de la provincia china de Heilongjiang.

            Las pezuñas, los hocicos y las lenguas de los dos cerdos, que forman parte de una camada de once, brillan en la oscuridad, al igual que le ocurre a su madre, según ha explicado Liu Zhonghua, director de la investigación efectuada en la Universidad de Agricultura Nororiental.

            "Esto significa que la tecnología para reproducir cerdos transgénicos a través de la transferencia nuclear somática (traslado de material genético de una célula a un óvulo) está madura"

        El experimento comenzó a finales de 2006, cuando los científicos crearon tres puercos, entre ellos la madre de los recién nacidos lechones, con partes de su cuerpo capaces de brillar en la oscuridad.

Proteínas de Medusas

       La proteína verde fluorescente es una proteína producida por la medusa Aequorea Victoria, que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta proteína está aislado y se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador.

   

    El 8 de octubre del 2008 los profesores Martin Chalfie          (estadounidense) , Osamu Shimomura (japonés radicado en los Estados Unidos) y Roger Tsein (estadounidense) han sido galardonados por la Real Academia Sueca de Ciencias de Estocolmo con el Premio Nobel de Química 2008 "por su descubrimiento y desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP)", herramienta indispensable para la biología y la medicina modernas.

Aplicaciones de la Fluorescencia

        Existen muchos compuestos naturales y sintéticos que exhiben fluorescencia, y tienen un sinnúmero de aplicaciones prácticas, desde la simple decoración fluorescente hasta aplicaciones en química analítica tales como FPIA. En la naturaleza hay múltiples ejemplos de organismos que utilizan la fluorescencia y en especial la quimiolumiscencia para atraer alimento o pareja, o bien para espantar a los depredadores o la bioluminiscencia.

Iluminación

              El común tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un vacío parcial y una pequeña cantidad de mercurio. Una descarga eléctrica en el tubo causa que los átomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el rango ultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el tubo se encuentra revestido con una capa de un material fluorescente llamado fósforo, el cual absorbe la luz ultravioleta y la reemite en el espectro visible. La iluminación fluorescente es energéticamente mucho más eficiente que la tecnología incandescente, pero el espectro producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es así porque el espectro de emisión no es continuo, sino que se encuentra formado por un limitado número de longitudes de onda (líneas de emisión).

                 A mediados de los años 1990, ya era tecnología común el LED de luz blanca, este tipo de LED funciona a través de un proceso similar. Típicamente, en estos dispositivos el semiconductor emisor produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un compuesto fluorescente depositado en el chip; y este fluorescente emite en la región verde y roja del espectro. La combinación de la luz azul que pasa a través del fluorescente y la luz emitida por el mismo produce una luz casi blanca.

             La Lámpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la misma forma que cualquier tubo fluorescente típica y con ventajas. Es utilizada para reemplazar lámparas incandescentes en muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen emitido que los bombillos incandescentes y duran hasta cinco veces más. Estas lámparas contienen mercurio y deben ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas lámparas tengan un balastro es que no encajan adecuadamente en todos los aparatos de luz.

Química analítica

          La fluorescencia puede ser detectada con un monocromador para encontrar emisiones típicas de compuestos presentes en una cromatografía líquida de alta eficacia. Además, permite visualizar las manchas producidas por una TLC si los compuestos o los reactivos de reveladores son fluorescentes.

              La fluorescencia es más efectiva cuando hay una gran proporción de átomos en los niveles bajos de energía en una distribución de Boltzmann. Existe entonces una mayor probabilidad que los átomos con energía baja sean excitados y liberen a su vez fotones, permitiendo así un análisis más eficiente.

Las huellas dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como la ninhidrida.

Bioquímica y Medicina

Algunos ejemplos:

• La microscopia de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares se consigue marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que aquél encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen.

• Secuenciación automática de ADN por el método de terminación de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTP se encuentra marcado con un fluorocromo específico, de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la longitud de onda emitida característica de cada fluorocromo.

• También, diversas moléculas biológicas tienen fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un ambiente específico, de tal forma que la distribución o el ligamiento de la molécula pueden ser medidos. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albúmina sérica en un sitio específico. La protoporfirina zinc y otras más.

• Es utilizada en (Citometría) de flujo para identificar diferentes receptores en las células estudiadas, marcando estas células con anticuerpos específicos conjugados a un fluorescente.

• Inmunología: los sitios de unión de un anticuerpo a un espécimen microscópico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo químico fluorescente al anticuerpo específico (IFI).

• La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformación del ADN, así mismo como de proteínas, con técnicas como la transferencia de energía de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms.

• La Proteína Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea Victoria, se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante. GFP y otras proteínas relacionadas son usadas como reporteros de un sin número de eventos biológicos incluyendo aquellos de localización subcelular. Los niveles de expresión génica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de producción de GFP con el gen de interés.

• El número de aplicaciones de la fluorescencia ha ido creciendo en el campo de la biomedicina, la biología y en otras ciencias relacionadas. Los métodos de análisis en estos campos también han ido aumentando. Muchas de estas técnicas se basan en los microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilizan fuentes de luz de alta intensidad, usualmente lámparas de mercurio o xenón, LED’s, o láseres, para generar fluorescencia en las muestras bajo observación. Posteriormente, los filtros ópticos separan la luz excitada de la fluorescencia emitida, para permitir que sea detectada a simple vista, empleando una cámara o utilizando algún otro detector de luz como espectrógrafos, etc. Muchas investigaciones se están llevando a cabo para mejorar ya sea el desempeño de estos microscopios, las sondas fluorescentes usadas, y las aplicaciones de las mismas. De interés particular son los microscopios con focales, los cuales utilizan un poro para lograr secciones ópticas, proporcionando una vista cuantitativa y en 3D de la muestra.

Gemología, mineralogía, geología y ciencias forenses

·         Las gemas, los minerales, las fibras y muchos otros pueden tener una fluorescencia distintiva diferente bajo luz UV o rayos X. Muchos tipos de calcita y ámbar presentarán fluorescencia bajo luz ultravioleta. Los rubíes, las esmeraldas y el diamante Hopeexhiben fluorescencia roja bajo luz UV; los diamantes también emiten luz bajo rayos X.

·         El petróleo emite fluorescencia en un rango de colores, desde el marrón mate para aceites pesados y alquitrán hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy livianos y condensados. Este fenómeno es usado en perforaciones hechas para la exploración de petróleo permitiendo identificar pequeñas cantidades de crudo en las perforaciones y en los poros de las muestras.

Líquidos orgánicos

        Los líquidos orgánicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno, emiten fluorescencia bajo la acción de radiación UV o rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de esta fluorescencia se encuentran en el orden de los nanosegundos ya que la duración de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del material fluorescente, en este caso antraceno.

Reglas de la Fluorescencia

Existen algunas reglas para predecir los comportamientos de la fluorescencia. La Regla de Kasha, por ejemplo, dicta que el rendimiento cuántico de luminiscencia es independiente de la longitud de onda de la radiación.

Esto no es siempre cierto y se contradice a menudo en muchas moléculas simples. Una declaración un tanto más confiable, aunque aún con excepciones, podría ser que el espectro de fluorescencia muestra muy poca dependencia con la longitud de onda de la radiación.

El diagrama de Jablonski describe la mayor parte del mecanismo de relajación para las moléculas en estado exitado.

Mecanismo

Consideraciones previas

Para entender el mecanismo subyacente al proceso de fluorescencia es necesario primero repasar el concepto de orbital atómico y de orbital molecular.

Los electrones en un átomo se organizan ocupando diferentes orbitales, esto es, regiones en el espacio en torno al núcleo donde existe una cierta probabilidad de encontrarlos. Existen orbitales de baja energía y orbitales de alta energía. Los electrones prefieren ocupar primero, y siempre que sea posible, los orbitales de menor energía que se encuentren desocupados. Sin embargo esto no significa que no puedan ocupar transitoriamente orbitales de mayor energía.

Transiciones electrónicas

Para mover un electrón de un orbital de baja energía a un orbital de mayor energía es necesario cubrir esa diferencia de energía con un aporte externo Para cada tipo de átomo la diferencia de energía entre dos orbitales dados es constante y los electrones se pueden mover entre esos orbitales únicamente ganando o perdiendo esa cantidad fija de energía. Este proceso se conoce como transición electrónica. En el caso de tratarse de átomos únicos esto provoca que cada tipo de átomo posea líneas de absorción y líneas de emisión muy características, es decir que sea capaz de absorber o emitir energía en forma de cuantos de luz a determinadas longitudes de onda correspondientes a cada uno de los procesos de de los electrones entre orbitales de diferente energía. En el caso de átomos únicos las líneas espectrales son muy precisas y definidas porque las transiciones entre diferentes orbitales poseen diferencias de energía muy marcadas y precisas.

Espectros moleculares

Cuando los átomos se combinan para formar moléculas, sus orbitales atómicos desaparecen, combinándose para formar orbitales meleculares. Los electrones ahora pueden ocupar regiones de probabilidad en torno a varios núcleos. La combinación de orbitales atómicos se produce en forma lineal, esto significa por ejemplo que si se combinan dos átomos, cada uno de los cuales posee cuatro orbitales atómicos, la molécula poseerá como resultado ocho orbitales moleculares. Estos orbitales moleculares poseerán energías intermedias a las de los orbitales atómicos que se combinaron para formarlos. La situación se va tornando más compleja cuantos más átomos posea una molécula. Como consecuencia moléculas relativamente simples poseen un número muy elevado de orbitales moleculares entre los cuales se pueden producir transiciones electrónicas. Es por eso que las moléculas poseen bandas de emisión y absorción y no líneas. Estas bandas se encuentran formadas por la superposición de una gran cantidad de líneas correspondientes a cada una de las transiciones posibles entre diferentes orbitales dentro de la molécula. Cuando se altera la forma de una molécula, también se altera la forma de los orbitales moleculares que la forman y como consecuencia se altera la energía de los mismos. Las deformaciones estructurales provocan ligeras diferencias entre las energías de diferentes orbitales que hacen que se modifiquen las energías de transición electrónica entre ellas. Finalmente cabe considerar que en una molécula en estado basal, muchos de los electrones se encuentran en estado singlete, es decir, se encuentran complementados por otro electrón dentro del mismo orbital con un espín antiparalelo. Las transiciones de espín, también pueden absorber y emitir energía en forma de luz.

Mecanismo básico y diagrama de Jablonski

Un diagrama de Jablonski es básicamente una representación simplificada de los niveles electrónicos (orbitales) de una molécula y de las posibles transiciones electrónicas que se pueden dar entre estos niveles. En un diagrama de Jablonski se agrupan verticalmente los estados electrónicos de acuerdo a su energía y horizontalmente de acuerdo a su multiplicidad de espín. Las transiciones radiactivas se representan con líneas rectas y las no radiactivas con líneas onduladas. A continuación se presenta un diagrama de Jablonski modificado para representar una molécula hipotética que posee un nivel electrónico basal (S₀) dos niveles electrónicos de alta energía (S₁ y S₂) y un nivel de dos orbitales degenerados con espines paralelos (triplete T₁) cada uno de estos niveles con varios subniveles vibracionales debidos a las deformaciones térmicas de la molécula (Vb). En el eje vertical se ubica la energía relativa de cada nivel electrónico, y en el eje horizontal hemos considerado al tiempo y no a la multiplicidad de espín. Las flechas verticales representan absorciones y emisiones de energía en forma de fotones y las flechas diagonales implican disipación de energía por medios no radiativos (en forma de calor).

La situación aquí representada comienza por la promoción de un electron que se encontraba en estado basal S₀ a un nivel electrónico de alta energía S₂ en un estado vibracional alto (la línea Vb más alta de todas). Esta promoción se produce cuando la molécula absorbe energía, en general en forma de un cuanto de luz. Este electrón en un estado electrónico excitado vibracionalmente alto puede ceder parte de su energía en forma de vibraciones que se transmiten al resto de la molécula (flecha amarilla diagonal rotulada como NR). Esta energía lo que hace es aumentar la amplitud de las vibraciones de la molécula, energía que es finalmente disipada cuando la molécula choca con otras moléculas cediendola en forma de calor.

El electrón puede ir cayendo como en una escalera entre diferentes estados vibracionales cediendo en cada escalón parte de su energía en forma de calor, que aumenta las vibraciones de la molécula. O puede por otro camino ceder toda su energía de golpe, cayendo a un nivel inferior y emitiendo gran parte de la energía en forma de un único cuanto de luz (situación representada por la primera flecha verde vertical).

Aunque en teoría sería posible que el electrón cayera desde el estado vibracional alto al estado basal S₀, en la practica esto no ocurre, pues la molécula rápidamente transfiere parte de la energía absorbida a otros orbitales por medio de un mecanismo de reconverción energetica externa, un proceso que ocurre usualmente en tiempos muy muy cortros del orden de 10^-15 segundos, por lo que resulta virtualmente imposible para el electrón ceder nuevamente el total de la energía que recibió, y como consecuencia la luz emitida es siempre de menor energía y mayor longitud de onda que la recibida. A medida que el tiempo se prolonga, mayor es la cantidad de energía que se pierde por procesos no radiativos y mayor es la longitud de onda de la luz emitida. Eventualmente todos los electrones en estados excitados caen hasta el estado basal ya sea emitiendo luz (FE) o perdiendo energía por procesos no radiativos (NR) estos procesos se producen en la fluorescencia en tiempos de hasta 10^-9 segundos.

En algunas moléculas sin embargo, existen orbitales degenerados con energías muy similares a las de los niveles exitados. En estas moléculas puede ocurrir que un electrón con alta energía ceda parte de su energía a un electrón en estado basal para formar dos electrones desapareados en dos orbitales degenerados (estado triplete) de energía intermedia. El estado triplete es metaestable y puede existir por tiempos enormemente largos si se lo compara con las transiciones entre estados dobletes; en el primer caso los tiempos de decaimiento usualmente van desde las centésimas de segundo hasta las horas. Cuando los electrones en estado triplete aparean sus espines ceden esa energía de apareamiento en forma de luz, produciendo el fenómeno de fosforescencia.

La relajación de un estado S₁ también puede ocurrir a través de una interacción con una segunda molécula mediante lo que se conoce como desactivación de la fluorescencia, en este caso la molécula excitada cede su energía a otra y esta última la disipa en forma de calor. El oxigeno molecular (O₂), por ejemplo, es muy eficiente desactivando la la fluorescencia de otras moléculas debido a su inusual estado triplete fundamental.

Finalmente algunas moléculas que se excitan a través de la absorción de luz o por medio de un proceso diferente (P. ej. a causa de una reacción química) pueden transferir esta energía a una segunda molécula‘sensibilizada’ por un mecanismo de paso intersistema entre moléculas. A través de este mecanismo la segunda molécula es conducida a un estado de excitación electrónica y es finalmente esta última la que va a emitir fluorescencia. En estos casos las diferencias de energía entre la radiación excitadora y la emitida son excepcionalmente grandes. Este mecanismo se utiliza por ejemplo en los contadores de centelleo líquidos para producir luz visible a partir de radiaciones nucleares de alta energía.